文章插图
蛋白质含量测定的方法有微量凯氏定氮法、双缩脲法、folin―酚试剂法、考马斯亮兰法、紫外吸收法等 。
1、微量凯氏定氮法：含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵 。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量 。
2、双缩脲法：双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物 。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应 。
3、folin―酚试剂法：这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一 。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代 。
4、考马斯亮兰法：1976年由bradford建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的 。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法 。
5、紫外吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质 。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比 。
①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16% 。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量 。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物 。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物 。比色定蛋白质含量 。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好 。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响 。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成 。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸 。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+，Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量 。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰 。步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差 。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定 。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定 。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量 。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色 。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色 。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强 。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比 。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀 。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少 。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procedure，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收 。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成 。灵敏度Lowry法相似 。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰 。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合 。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定 。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之 。含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属 。
推荐阅读
- 《画江湖之不良人》中，倾国倾城的实力如何？是什么身份？
- 大学生入党的好处
- 网上节电器真的能省电吗 节电器真的能省电吗
- 绥宁有什么旅游景点
- 我是1987年属兔的，请问我的婚姻和什么属相比较相配
- 属兔的人明天2月4号忌讳什么
- 爱情中，十二星座可遇不可求的那个人？
- 祸从口出，最易因为大嘴巴而得罪人的星座有哪些？
- 男人眼中的优秀生肖女
- 处女座的人和双子座的人, 哪个更厉害?