引物二聚体(pcr引物二聚体特别亮)
基本原理
聚合酶链式反应(PCR)是一种体外特异性核酸序列扩增技术 。模拟DNA的自然复制过程由三个基本反应步骤组成:变性-复性-延伸 。根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成两条不同的寡核苷酸引物，与两条DNA链互补 。将适量的寡核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)混合 。DNA聚合酶和含有靶序列片段的模板DNA分子 。经过高温变性(解开DNA双链)、低温复性(将引物附着在模板上)和中温延伸(合成新的DNA片段)三个阶段的一个循环后，DNA的量可以增加一倍，30个循环后，DNA的量可以增加230倍 。
典型的PCR反应系统和PCR的三个阶段
典型的PCR反应系统组成:
【pcr引物二聚体特别亮 引物二聚体】DNA模板
反应缓冲液
两个合成的DNA引物:dNTP和MgCl2(分别为上游引物和下游引物)
耐热Taq DNA聚合酶等 。
PCR的三个阶段如下:
模板DNA的变性:将模板DNA加热到94℃左右一定时间后，模板DNA双链或PCR扩增形成的双链DNA解离，从而可以与引物结合，为下一轮反应做准备；
模板DNA和引物的复性:当温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对；
引物延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种dNTP为反应原料，以靶DNA序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，由DNA模板-引物偶联物合成一条与模板DNA链互补的新的半保守复制链 。反复变性-复性-延伸可以获得更多的半保守复制链，这个新链可以成为下一个循环的模板 。
实验用品
1.材料
枯草杆菌AS 1.398的基因组DNA溶液
2.试剂
2×Taq酶PCR反应混合物(含Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2和4种dNTP)；
上游引物，下游引物
石蜡油；
琼脂糖；
10×TBE电泳缓冲液:称取Tris108g、硼酸55g、Na2EDTA7.44g和双蒸水至1000mL
6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液；
EB溶液母液:将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹；
DNA纯化试剂盒
DL2000TM DNA标记
3.工具
超级洁净工作台
加压釜
高速离心机
移液管
PCR放大器
卧式电泳槽
电泳仪电源
凝胶成像系统
电饭锅/电炉
实验步骤
引物设计
在NCBI上搜索枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶(ALP)的基因序列，使用枯草芽孢杆菌亚种的碱性磷酸酶基因序列 。以枯草杆菌str.168为模板设计引物 。根据DNA序列和表达质粒载体pET-28a-c (+)的图谱，用Primer Premier 5.0软件设计两对引物 。上游引物和下游引物分别具有BamH和Hind的限制性酶切位点，这两个不同的限制性酶切识别位点分别在引物中加下划线 。引物序列如下:
上游引物:
5 '-cgggatccatgaaaaaaatgagttgt-3 '(BamHⅰ)
下游引物:
5 '-ccgaagcttttttttccagtttt-3 '(Hindⅲ)
基因增殖
使用提取的基因组DNA作为反应模板，用合成的引物通过PCR扩增编码ALF的DNA序列 。
加入上述试剂后，离心5 s混匀，加入20 μL石蜡油覆盖混合物，防止PCR时样品中的水分蒸发 。
当所有反应完成后，将PCR仪的温度设置为保持在4℃ 。反应后，每个样品5μL经1%琼脂糖凝胶电泳检测，基因长度约为1400bp 。添加样品DL2000TM DNA标记作为电泳标记 。电泳后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照 。
产品纯化
DNA纯化试剂盒用于纯化，具体步骤如下:
(1)PCR结束后，将PCR反应管中的反应液转移至干净的1.5mL Eppendorf离心管中，加入4倍体积的结合缓冲液混匀 。将纯化柱放入收集管中，将混合溶液转移到柱中，并在室温下放置2分钟 。
(2)以12000转/分钟的速度离心1分钟 。
(3)倒出收集管中的废液，将纯化柱放入同一收集管中，加入600 μ l洗涤液，12000 r/min离心1 min 。
(4)重复步骤(3)一次 。
(5)倒出收集管中的废液，将纯化柱放入同一收集管中，以12000 r/min离心2min 。
(6)将3S柱放入另一个1.5 mL离心管中，向纯化柱膜中心加入30 μ L TE，在37℃静置2 min 。
(7)7)12000 r/min离心1 min，离心管内液体即为回收的DNA片段，可立即使用或-20℃保存备用 。
需要注意的事项
1.1的灵敏度 。PCR反应很高 。为了防止污染，使用的0.2 mL Eppendorf管和吸头必须是新的、无污染、无酶的 。实验操作应尽可能在无菌手术台上进行 。
3.使用工具酶和DNA样本的操作必须在冰浴条件下进行，使用后的剩余部分应立即放回冰箱 。
3.应该有一个阴性对照，包含除模板DNA以外的所有其他成分 。
4.使用的引物浓度一般为0.1 ~ 1.0 μ mol/L，浓度过高容易形成引物二聚体或增加非特异性产物 。太低会影响效率 。
