2、分装,因为母种培养基的温度降到45度以下时会凝固,所以制备好的培养基要尽快乘热分装入试管 。试管规格为直径20毫米,长200毫米 。分装时使每支试管的分装量相当于试管长度的四分之一左右,分装好后还要进行封口,可以用未经脱脂的原棉,塞入的松紧度以用手抓棉塞不脱落为标准 。
3、灭菌,制好的试管还要进行灭菌,把6到8个试管捆成一捆 。首先在试管上包上一层报纸,报纸的作用是防止灭菌时产生的冷凝水粘湿棉塞甚至流进试管里 。接着用橡皮筋把包好后的试管扎成捆 。这样做是防止试管在高压锅中加热时倾倒,随后把试管放入高压锅中进行灭菌 。灭菌时高压锅的压力为0.15兆帕,持续灭菌30分钟,这样的压力下灭菌锅的温度一盘在120摄氏度 。加热停止后自然冷却2小时 。灭菌后的试管都要乘热放在一个斜坡上,要让试管保持倾斜,要将倾斜度操持在20度,以培养基占试管的三分之二为标准 。大约半个小时后,由于琼脂的凝固作用试管中的培养基就凝固了 。这样母种培养基就做好了 。
4、接种 。接种要在无菌室中的操作台上进行,接种前首先要准备好以下工具,酒精灯,酒精棉,接种铲和接种耙 。
接种时接种人员的手和接种针要用75%的酒精棉球擦洗,之后点燃酒精灯,使火焰周围空间形成无菌区 。接着一手拿着接种铲在火焰上进行灼烧灭菌,一手拿着培养基试管和母种试管,试管口也要在火焰上稍微烤一下以杀来管口上的杂菌 。把试管上的棉塞取下,用接种铲取一块体积大约为1立方厘米的母种,迅速放入母种培养基试管斜面的中部,这时要注意,试管的接种铲都要靠近酒精灯火焰,不能离开无菌区,否则会感染杂菌 。然后塞上过火焰后棉塞,接下来按照同样的***连续操作就可以了 。每支母种试管可以扩接母种培养基试管30支左右 。接下来就要进行母种培养 。
5、母种培养 。培养室的温度应控制在23摄氏度左右,正常情况下培养一个星期就萌发菌丝了 。如果菌丝萌发好以后还不需要接种的情况下,要把发好菌丝的试管放在冰箱里防止菌丝老化 。
三、 *** 枝条种
1、 *** 枝条种培养基 。首先要对枝条种进行处理,处理的 *** 如下,先往容器里到水,然后加入石灰,搅拌均匀后使水的PH值在8—9之间 。在把枝条种到进水里,用筛网罩住,上面压上砖块,目的是为了防止枝条种漂浮不能充分地进入石灰水 。枝条种需要浸泡24小时,浸泡好以后还要把枝条种和麦麸搅拌在一起,这样是为了增加枝条种的营养 。以搅拌均匀后枝条种表面的麦麸均匀布满更好 。
2、原种培养基配方 。锯木屑39%、麸皮20%、白糖0.1%、轻质碳酸钙1%、含水量65%左右 。
3、装袋及灭菌 。装袋前要先准备好宽15厘米,长30厘米,厚0.05毫米的聚乙烯塑料袋,把准备好的培养料放入袋中五分之一处 。每个袋子里放30根左右的枝条种,让它们紧靠在塑料袋内壁,多余的部分填满培养料 。装好后还要用盖子进行封口,选用的塑料盖子里面装有杂质棉并布满了小孔,这种盖子不但可以防潮,还可以透气,过滤杂菌 。这些工作完成后把培养袋转移到高温灭菌器里进行高温灭菌处理 。培养袋装好后,将高温灭菌器完全封闭,然后在开始加热 。加热三个小时后,灭菌室里的压力达到0.15兆帕,温度达到121摄氏度时就可以了 。加热完成后不要马上打开高温灭菌器,要等待30分钟左右待菌袋冷却后就可以将菌袋取出进行接种 。
4、原种接种 。原种接种工作也要在无菌操作台上进行,操作前的消毒工作和母种接种时是一样的 。消毒完成后从母种试管中挑取一立方厘米的菌种块轻轻放入原种菌袋中,并及时用盖子进行封口 。这里需要注意接种时的母种试管要始终对着酒精灯的火焰,可以起到防止其它杂菌侵入,感染菌袋 。正常情况下1支母种试管可以接种3—4个菌袋,接种完成以后就可以将菌袋入到培养室中了 。
5、原种培养 。菌袋摆放在培养架上,菌种培养期间室内的温度要保持在22—25摄氏度之间,相对湿度在60%左右,这样的温湿度下菌丝的生长速度是最快的,一个月以后就开始萌发菌丝了 。这期间需要做哪些管理呢,通常在原种培养室只要掌握好室内温度,保证室内光线阴暗就可以了 。另外每天还要打开室外的排风扇换气3次,每次打开的时间在半个小时内 。长出菌丝后,管理人员还要不定期的检查培养袋,如果发现有杂菌感染的菌袋要及时清理出培养室,以防感染其它菌袋 。待菌丝长满菌袋后就可以进行栽培种的扩繁工作了 。
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