质粒提取质粒提取流程

2024-01-29 知识经验

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大家好,小龙来为大家解答以上的问题。质粒提取流程，质粒提取这个很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧！
【质粒提取质粒提取流程】1、需要掌握技能1.质粒转化具体操作步骤：?将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管；?将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；?轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min；?42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；?每管加500ul LB培养液，放37℃水浴1h；?吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；?倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
2、2.质粒的抽提具体操作步骤：?用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；?将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶?37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10ml LB培养液 37℃剧烈振摇培养16 h；?取4ml菌液到5ml 离心管，8000rpm室温离心3min；? 去上清，放于面巾纸上吸干痕液，?加250 ul Solution Ⅰ（注意用前应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；?加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ；?加350 ul Solution Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；?将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中，?室温孵育2-3min，12000rpm 4℃离心15 min；?装配2ml 收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）?将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；?8000rpm室温离心3min；?去掉收集管中的液体，加500ul Buffer HB 到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min；?去掉柱状收集管中的液体，加750ul Wash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1min；?重复上述步骤一次；?不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min；?将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA 。
3、3.质粒电泳具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：?用50ml量筒量取20ml 1XTAE；?用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；?将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s ，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；?至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；?至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；?向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；?将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下：如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3ul 10X上样缓冲液；?将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30min ，关掉电源，在Dark Reader荧光透射仪观察结果。
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