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lncRNA的套路分析 lncrna引物设计

基因序列探针转录

lncRNA引物设计(lncrna常规分析)
摘要
非编码RNA (ncRNA)参与表观遗传调控，但对其知之甚少 。在这里，我们描述了11个解剖位点中4个人类HOX基因座的转录景观特征，分辨率为5个碱基对，并鉴定了231个HOX ncrna，它们将已知的转录区域扩展了30多千个碱基 。HOX ncrna沿着发育轴空表达，具有独特的序列基序 。它的表达定义了在组蛋白甲基化和核糖核酸聚合酶可及性方面不同的一系列染色体结构域 。
研究成果
【lncRNA的套路分析 lncrna引物设计】图1
图1:1:HOXA基因座的人HOX转录组 。
(a)位点特异性转录 。左图:50，532个探针的杂交强度，这些探针拼接了11个样品中每个样品的人HOXA基因座(用圆圈编号) 。每个探针的强度表示为单个探针的强度除以阵列上所有301，027个探针的平均强度的log2的比值，每个探针的log2比值取100 bp窗口的平均值；红色条和绿色条分别表示高于或低于阵列平均值 。编码蛋白质HOX的基因的基因组位置显示为棕色方框 。右图:11个成纤维细胞样本关于发育轴的解剖起源 。
(b)通过瓦片阵列上的连续信号识别转录区域，然后与Refseq序列进行比较，以确定基因[外显子(粉色)和内含子(蓝色)]以及基因间转录区域(紫色) 。每个预测的HOX外显子或内含子分别被命名为HOXn或int-HOXn 。基因间转录区被命名为nchoxn，其中n是位于HOX编码链中NC RNA 3’端的HOX视差图 。
(c)所有四个HOX基因座的转录区概述，它定义了HOX基因、内含子和ncRNA转录区的数量 。
图2
图2:2:HOX ncRNA和一级序列基序的位点特异性表达 。
(a)HOX编码的转录本沿近端-远端轴差异表达 。60个转录区(12个HOX基因和48个ncRNA)在远端成纤维细胞样本(脚、手指、包皮和前列腺)和所有其他细胞之间差异表达(P 0.05，Student t检验) 。高于或低于总中值的每个转录区域的表达水平用色标表示(在线性标度上为3至0.3倍或log2标度上为+1.6至-1.6倍) 。转录本区域根据它们在染色体上的位置进行排序，样本通过这60个转录本的表达相似性进行分层聚类 。HOX与飞行超级胸(UBX)或触角肚(Antp)的侧支同源基因的进化起源分别用蓝色和黄色方框表示 。
(b)由HOX编码的转录本沿前部和后部解剖区域差异表达 。共有92个转录本(6个HOX基因，86个ncRNA)在原代成纤维细胞培养前后(脐上或脐下)差异表达(P 0.05，学生t检验) 。每个ncRNA的表达如(a)所示 。
(c)根据其表达模式，序列基序富含HOX ncRNA(第10-9页) 。富集在非翻译HOX序列一级序列中的序列基序的标志图超过了非翻译的序列，或者在非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译的非翻译在前解剖部位表达的ncRNA的一级序列基序并不比预期的多 。
图3
图3:占据HOXA基因座的Suz12、H3K27me3和pol II在原发性肺(上)或足(下)成纤维细胞(Fb)HOXA基因座的~100 kb转录活性中与染色质修饰和转录可及性完全相反 。对于芯片数据，芯片/输入的log2比率绘制在Y轴上 。对于核糖核酸数据，杂交强度以线性标度显示 。虚线突出了染色质修饰和基因间转录之间相反构型的边界 。
图4
图4:4:HOXC位点反义基因之间ncRNA HOTAIR的长度 。
(a)hot air在两个染色质域边界的基因组位置 。芯片和RNA在拼接阵列上的表达如图3所示 。
(b)链特异性逆转录聚合酶链反应显示HOTAIR在HOXC基因的相反链中的独特表达(底部) 。逆转录引物和聚合酶链反应引物被设计成特异性靶向HOTAIR的顶部(引物F1-F3)或底部链(引物R1) 。
肺和包皮成纤维细胞核糖核酸中热空气体的Northern印迹分析 。
(d)通过含有HOTAIR寡核苷酸池(第1-3组)和全长反义HOTAIR或miRNA let7a的探针检测大小片段的小RNA 。
(qrtpcr检测人成纤维细胞后部和远端的HOTAIR表达 。每个成纤维细胞样本的来源由解剖图上的样本号表示 。“一”来自头皮 。X轴上显示了相对于头皮(最前面)的每个位置的热空气相对丰富度 。
(f)在10.5日龄全胚胎(上图)和后肢及尾部(左下图和右下图)中，用HOTAIR sense(底链)或antest(顶链)探针进行全胚胎原位杂交 。HOTAIR后肢(箭头)和尾巴(箭头)的表达突出显示 。
图5
图H3K27三甲基化和5:HOXD点占领Suz12需要HOTAIR 。
(A)h3k 27me 3 ChIP-ChIP信号A) HOXD基因座的改变是由于HOTAIR的耗竭引起的，与对照siRNA抗GFP相比 。HOXD基因的位置用棕色方框表示 。
(b)靶向GFP或HOTAIR的siRNA治疗后，H3K27me3的ChIP和HOXD位点选择性启动子的Suz12 。底部:ChIP检测量化(平均标准误差) 。

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