PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板 。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝 。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升 。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算 。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数 。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值 。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素 。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的 。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分 。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段 。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在之一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段” 。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合 。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段” 。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用 。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带 。ATGC更好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带 。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列更好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 。
引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以更低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶 。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 。
推荐阅读
- 检查生病kmh1是什么意思的简单介绍
- 白带检查结果符号是什么意思的简单介绍
- 医院检查报告表箭头是什么意思啊 医院检查报告表箭头是什么意思
- 30岁以下不建议检查hpv「30周不检查可以吗」
- 心电图是啥意思 心电图检查的什么意思
- 孕检小排畸查胎儿偏小三周，大排畸检查胎儿偏小两周
- 新冠核酸检查阴性是什么意思「新冠核酸检查阴性是正常的吗」
- 定期做检查的意思 定期检查是什么意思
- 国家免费孕检都检查什么项目 国家免费孕检19个项目
- 检验tc是什么意思 tcy检查是什么意思