灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平 。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌 。
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应 。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广 。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测 。PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增 ,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论 。PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析 ***。
凝胶电泳分析:PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性 。PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件 。
琼脂糖凝胶电泳: 通常应用1~2%的琼脂糖凝胶,供检测用 。
聚丙烯酰胺凝胶电泳:6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析 。
酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究 。
分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效 ***。
Southern印迹杂交: 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交 。此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研 。
斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析 。
核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可
5pcr检查是什么聚合酶链式反应,简称PCR 。其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种 *** ,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点 。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有 DNA,RNA的地方.聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术 。由美国科学家PE(Perkin Elmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr. Mullis发明,由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义,因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖 。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径 。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝 。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链 。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制
简略点,就是运用专门仪器,使用dNTPS、Mg2+、特异引物、DNA聚合酶以及缓冲体系,加入模板也就是DNA样品进行体外扩增,结果进行电泳,如果能扩增出,并且扩增的产物大小与目的条带一致,那说明引物与模板特异,检测指标就是阳性 。
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