dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性 。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris 。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存 。多次冻融会使dNTP降解 。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配 。浓度过低又会降低PCR产物的产量 。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化 *** 通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本 。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的 *** 白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸 。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 。一般临床检测标本，可采用快速简便的 *** 溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增 。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA 。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜 。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数 。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点 。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性) 。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响 。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败 。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合 。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度 。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想 。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合 。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行 。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合 。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的 。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min 。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现 。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度 。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度 。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 。
PCR反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性 。
其中引物与模板的正确结合是关键 。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的 。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度 。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高 。
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