农杆菌介导的转基因玉米种子的获得?( 二 )


在农杆菌介导小麦基因转导方面,Cheng等于1997打破了十几年的沉默,首次获得的正常的转基因小麦植株 。2年后,我国科学工作者夏光敏等报道获得农杆菌介导的转基因小麦植株,笔者的研究组也同样成功地获得农杆菌介导的转基因小麦植株(待发表) 。这种成功意味着,小麦也能象双子叶植物一样享受农杆菌介导基因转化的所有优点 。
结合农杆菌介导与基因枪法的“Agrolistic”法,或通过微弹造成的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移,或把分别携带有 VirDl、VirD2和T-DNA的边界序列加外源片段的三个质粒导入受体,通过VirDl和VirD2在受体中的正常表达促使外源目标片段采用T-DNA边界序列以较低的拷贝数插入受体的基因组中,已经在小麦的基因转化上崭露头角 。超声波辅助的农杆菌介导法(Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation,SAAT)通过超声波在受体细胞上产生的微孔来帮助农杆菌附着及其所含质粒向受体细胞的转移,使外源基因在小麦受体细胞的瞬时表达强度相对纯农杆菌法增加至少100倍 。Singh和Chawla和Serik等还利用碳化硅纤维(silicon carbide fibeers)来辅助农杆菌转基因 。此外,还有结合农杆菌与病毒的“Agroinfection ”法等 。这些方法目前虽然还不成熟,但在小麦基因转导方面具有很大的潜力 。
2、小麦基因转化的受体
作为基因转化的受体取决于所用的转基因方法,而受体操作的难易程度又决定了转基因方法的成败 。
小麦胚性悬浮细胞及其分离出的原生质体多用作电激法、PEG法和显微注射法等直接转基因法的受体 。正是由于原生质体和悬浮细胞再生植株的困难,使电激法等直接法在小麦的基因转化方面没有多少“用武之地” 。小麦的胚性愈伤组织,特别是幼胚及其愈伤组织和幼胚盾片及其愈伤组织具有较强的植株再生能力 (有人认为它们具有较大比例的全能性细胞),无论作为基因枪法的受体还是作为农杆菌介导法的受体都能再生出转基因植株,从而成为迄今为止小麦基因转化的主要受体,同时也使基因枪法成为目前小麦的主要转基因方法,也有可能使农杆菌介导法成为今后小麦基因转化的主要方法 。笔者研究组近年的实验结果 (待发表)表明,小麦花药愈伤组织的再生能力很强,经基因枪轰击后比较容易获得转基因植株,因而也是小麦转基因的良好受体 。小麦的各种分生组织作为“手持式”基因枪的受体具有较大的利用潜力,但这一潜力的发挥还有待这种基因枪本身的完善和经济可利用性 。雌蕊,作为花粉管通道法及农杆菌一花粉通道法的唯一受体,随着这些转基因方法的完善将在小麦转基因方面发挥越来越重要的作用,有可能发挥主导作用 。小孢子、花粉、大孢子和叶基作为小麦转基因的受体可能得到进一步的开发,但在不久的将来,不可能成为主要受体 。幼穗可能是进行小麦基因转化一个很好的受体 。陈梁鸿在比较幼穗和幼胚为受体的转化试验中观察到,幼穗的转化效果优于幼胚 。
3、小麦基因转化的目标基因和选择
标志基因到目前为止,在双子叶植物基因转化中常用的选择基因和报告基因仍然多作为小麦遗传转化的目标基因兼选择基因,这些基因主要有报告基因类的GUS、CAT和LUC抗抗生素类的NptII、Hpt和抗除草剂类的Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX 。这些基因在小麦上利用主要是为了建立有效的遗传转化系统 。随着小麦遗传转化体系的建立和完善,旨在改良小麦性状的真正的目标基因的利用不断增多 。迄今为止,已经导入小麦并在转基因植株中得到表达的目标基因主要有:①改良小麦加工品质方面的基因:高分子量谷蛋白亚基(HMW Glutenin subunit)基因lAxl、lDx5和lDxl0和重组高分子量谷蛋白亚基基因 。②抗病基因:病毒外壳蛋白基因(Coat protein genes,CP)、类萌芽素蛋白(germin-like proteins,GLPs)基因、水稻thaumatin-like 蛋白基因TLP、藜芦醇合成酶(stilbene synthase )基因、大麦种子核糖滞活蛋白(ribosom-inactivating protein,RIP)基因和玉米Ds转座子③嵌合雄性不育类基因:核糖核酸酶类基因Barnase、细胞骨架蛋白基因等④抗除草剂类基因:Bar、EPSPs、Bxn、CP4和GOX 。
在双子叶植物上广泛作为选择基因的抗抗生素类基因,如NptII和Hpt等,在小麦转基因上应用较少 。其主要原因有两个:第一是小麦对Kan具有较高的天然抗性,第二是,人们对小麦含抗生素基因的安全性的忧虑 。到目前为止,在转基因小麦中应用得最多的选择基因是抗除草剂基因Bar 。
【农杆菌介导的转基因玉米种子的获得?】

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