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农杆菌介导的转基因玉米种子的获得？( 三 )

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报告基因GUS、CAT和LUC曾为小麦基因转化体系的建立作出重大贡献 。但在小麦转基因体系基本成熟的今天，人们已经开始寻求其它的基因以代替上述单纯的报告基因或者根本不再利用报告基因 。值得一提的是外观可见报告基因(visual marker) 。McCormac等和Mentewab等用花色素苷生物合成促进基因(anthocyanin biosynthesis stimulatory genes)，如Cl/Lc，作为报告基因，通过对转化受体及其细胞的颜色来选择转化子 。这是一种具有广泛应用价值的报告基因 。另外，合成的绿色荧光蛋白基因(SGFP-S65T)也已用于报告小麦的基因转化 。
4、外源基因在转基因小麦中的表达与表达分析
广泛应用于在转基因植物中组成型表达外源基因的启动子CaMV 35s在谷物类中的作用较弱 。为了增强外源基因在转基因小麦中的表达，人们或利用双CaMV35s序列，或加入单子叶植物基因的插入子(如玉米Adhl基因的插入子)，或转而利用单子叶植物基因的启动子，如水稻的Actl基因的启动子和玉米Ubil基因的启动子 。Actl和Ubil启动子是目前在小麦转基因中应用最普遍的组成型启动子 。另外，人工重组的组成型启动子pEmuGN启动外源基因在转基因小麦等的表达强度比CaMV35s高至少10倍 。这类重组启动子在小麦遗传转化上将大有作为 。
组织和/或器官特异性表达启动子的应用在小麦转基因上是一个巨大的进步 。特别值得一提的是花药花粉特异性启动子的利用 。De Block等以水稻花药绒毡层特异性启动子ca驱动核糖核酸酶基因Barnse在转基因小麦中表达，从而在世界上创造出第一株基因工程雄性不育小麦 。笔者的研究组利用烟草花药绒毡层特异性启动子TA29也创造出基因工程雄性不育小麦 。基因工程雄性不育小麦的完善与配套，将彻底改变目前杂交小麦制种难的状况 。另外，化学诱导性启动子在转基因小麦上也具有巨大的应用潜力 。
近年来，对外源基因在转基因小麦上的整合、表达方式已经有一定的研究，包括分子方面的研究 。一般认为，外源基因在转基因小麦上的整合方式与所用的转基因方法有关，但无论是用基因枪还是农杆菌介导法，低拷贝与简单的整合仍然是占优势的整合方式；导入基因的遗传在大多数转基因系法后代中呈孟德尔遗传 。Bieri等的实验证明，与MARs(matrix-associated regions)的目标基因(RIP)在转基因小麦的后4代仍然非常稳定，但Alvarez等观察到在T2代有极少数植株丧失了整合的外源基因 。据Uze等报道，外源基因无论以单链还是双链，无论是以线形还是以环形，都可以整合到小麦的基因组，但线形基因的转化效率更高 。Zupan等观察到，农杆菌VirE2蛋白能在转基因植物细胞中协调细胞核吸取单链DNA 。Srivastava等报道了“位点特异性重组” (site-specific recombination)方法，他们利用这一方法成功地将4个4拷贝插入基因位点转化成单拷贝基因 。
此外，Pederson等还利用荧光原位杂交(FlSH)研究了基因枪法导入的基因在转基因小麦染色体上定位 。他们观察到，同一品种 (Florida)的不同转基因株系，外源基因的插入位点不同，例如，一个株系的插入点在染色体6B，而另一株系的插入点在染色体2A 。这类研究的深入，将有助于了解插入基因的“位置效应”，从而更好地了解外源基因在转基因小麦中的表达及其稳定性 。
5、小麦基因转化存在的主要问题
尽管转基因小麦的研究近年来进展很快，但与双子叶植物相比，甚至与同为谷物类的水稻和玉米相比，仍然有较大的差距 。最明显的差距是，转基因双子叶作物已经有几十个种类的120多个品种已经用于生产实践或已经被批准进入大田实验，转基因水稻和玉米有若干品种也已经用于生产实践，而转基因小麦基本还处在建立和优化转基因体系阶段 。笔者认为，造成这种差异的主要原因或在小麦转基因方面存在如下的问题：
第一，也是最主要的，小麦组织培养技术问题 。小麦组织培养中植株再生率低和基因型依赖性很强的问题是限制转基因成功及大幅度提高转基因小麦数量的瓶颈 。植株再生性强的小麦品种，如Bobwhite等，无论用基因枪法还是农杆菌法都己经得到转基因植株，而再生性差的品种则用基因枪也无法得到转基因植株 。也正是由于品种的再生问题，使全世界的转基因小麦都集中在少数几个基因型，而这些基因型又并非生产实践所需要的或在生产实践中的应用很有限 。
第二，基因转化的受体比较单一 。未成熟胚及其衍生物是小麦转基因的主导受体，而在世界发展中国家，有条件周年提供小麦未成熟胚者寥寥无几 。

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