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农杆菌介导的转基因玉米种子的获得？( 四 )

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第三，过份依獭基因枪法 。目前转基因小麦90%以上是用基因枪法获得的，而基因枪法转基因的缺点在双子叶植物上已经表现得很明显，在此毋须多言 。其实，这两个原因在本质上是由第一个原因所引起的 。另外，基因枪昂贵的价格也是附带因素 。
第四，对农杆菌转化单子叶植物，特别是转化小麦的机理缺乏系统而深入的研究 。目前人们已经认识到，不同种类的农杆菌对同一种单子叶植物的侵染能力不同，甚至同一菌株在不同的培养条件下侵染能力也有明显差异 。而包括小麦在内的一些单子叶植物本身也存在着一些不利于农杆菌侵染的因素，如，细胞壁的果胶多糖的高度酯化而缺乏农杆菌的附着位点分泌的愈伤诱导物少或缺乏或与双子叶植物存在明显的差异，不利于农杆菌的转化等 。正是由于这些了解，人们通过选用适宜的农杆菌菌株和植物表达载体、提高侵染时农杆菌的浓度和延长侵染时间、在共培养时加入vir基因活化剂 (如AS，OH-AS，双子叶植物伤流等)以及选用合适的受体基因型、外植体和培养基等，使农杆菌转化小麦有了重大突破，成功地获得转基因植株 。
第五，小麦本身为异源6倍体，基因组较大而复杂，导入的外源基因的沉默与修饰更为严重 。
第六，对转基因小麦分子生物学证据作用的过分依赖 。这在某中意义上曾扼制了极有优势的花粉管通道法在小麦转基因上的应用 。
6、转基因小麦的展望
随着小麦多种基因转化体系的建立或初步建立，小麦的转基因研究的进展在今后5年将会更快 。但这种进展将以更高效的植株再生体系的建立和完善为基础 。以基因枪为主体的转基因研究将转向以农杆菌介导法为主体转基因研究，这一研究将会优化或完善农杆菌介导的小麦转基因体系 。同时，基因枪法转化小麦将从研究阶段进入应用阶段，因而将有少量转基因小麦品系或品种进入大田试验或作为品系、品种释放 。花粉管通道法，特别是它与农杆菌结合的方法将被人们普遍接受并广泛用于小麦转基因的实践 。各种辅助农杆菌介导的方法将走向成熟 。抗抗生素基因作为选择基因将基本在小麦转基因上消失，代之而来的将是不同的抗除草剂基因、不同糖类和激素类基因 。明显易见而又对小麦有益的报告基因，如花色素基因等将会得到较普遍的应用，因而转化子的选择效率将大为提高 。更多的优良农业性状基因将被导入和表达，特别是提高面粉，营养价值、改良面粉加工性状的品质基因、提高植株抗病性的基因、提高植株抗旱性的基因和促进植株氮的有效利用基因 。更高强度的启动子和组织、器官特异性启动子将会被普遍利用，化学剂可调控启动子也将在部分先进的实验室利用，象 “位点特异性重组”等单拷贝插入技术将更加完善并得到应用 。基因工程雄性不育体系将会得到完善，并初步用于杂交种子的生产 。抗除草剂基因也将用于控制杂种的纯度 。另外，对外源基因的插入位点和插入方式将有比较清楚的了解，从而对外源基因的表达与沉默将有更清楚的了解 。同时，反义基因技术将初步用于对小麦功能基因的研究 。
或
一、植物的遗传转化
20世纪70年代末80年代初，人们用野生型Ri和Ti质粒转化烟草和马铃薯细胞获得再生植株后，以Ti质粒为载体的植物遗传转化技术随之被建立 。近年来植物的遗传转化技术得到了迅速发展，建立了多种转化系统 。按照基因引入受体植物细胞的方法，植物遗传转化技术大体可分为两类：以载体为媒介的基因转移和基因或DNA的直接转移 。所谓以载体为媒介的基因转移就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将外源基因转入植物细胞的技术 。DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术 。
（一）载体法转化 农杆菌介导的转化是最主要的一种载体转化方法 。利用经过改造的农杆菌Ti质粒为载体可以高效地转移外源基因 。所获得的转化植物有两种基本方法：一种是1979年Marton等以植物原生质为受体的共培养法（ocultivation）；一种是1985年Horsch等人建立的叶盘法（leaf disc cocultivation） 。
共培养法是把农杆菌与植物原生质体共同培养以实现转化的方法 。其程序包括农杆菌对初生细胞壁的原生质体的转化、转化细胞的筛选和诱导转化细胞分化并再生植株 。
叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法 。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养 。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移 。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株 。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径 。

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