细胞系构建(稳定细胞系构建)
构建稳定细胞植物的常用技术方法
1.基因过表达稳定细胞系的构建
(基因过表达多克隆细胞系构建服务，基因过表达单克隆细胞系构建服务):
过表达细胞系构建服务包括靶基因过表达慢病毒载体的构建、病毒包装、细胞转染和筛选 。客户只需要提供目的基因的cDNA质粒和要构建的细胞系 。我们将根据您的要求完成目的基因过表达细胞系的构建和检测，为您提供优质的基因过表达稳定细胞系 。
2.RNA敲除稳定细胞系的筛选
(RNA干扰基因敲除细胞系多克隆构建服务、RNA干扰基因敲除细胞系单克隆构建服务):
我们的RNAi敲除细胞系是基于慢病毒表达系统 。一般采用U6启动子驱动的pLVshRNA-puro载体或pLVshRNA-EGFP(2A)puro载体构建RNA干扰稳定细胞系，其服务包括干扰载体构建、靶标筛选、干扰效率验证和稳定细胞筛选克隆 。
3.CRISPR敲除稳定细胞系的构建服务；
随着TALEN和Cas9/gRNA基因敲除系统的出现，靶向基因敲除的难度大大降低 。全新技术将基因敲除从昂贵耗时的ZNF系统变成了简单的研究工具 。现在我们可以为Talen和Cas9/gRNA系统提供基因敲除服务 。包括基因敲除靶标设计、TALEN质粒组装、Cas9/gRNA质粒构建和基因敲除效率验证 。
稳定细胞系的筛选方法
1.质粒转染后，用单克隆方法筛选稳定的细胞系:
大多数细胞的转染效率较低 。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，则基因过表达是可以接受的 。然而，对于基因干扰实验，对转染效率的要求远高于基因过表达，质粒转染不能满足要求 。
此外，质粒在细胞质中游离，降解快，长时间不能满足检测项目；质粒转染整合的概率极低，构建稳定的细胞系费时费力，产量极低，因此往往需要选择单克隆系 。
2.筛选稳定的病毒感染细胞系；
病毒感染法比质粒转染筛选单克隆方法更方便高效，是目前稳定细胞系的主流筛选方法 。慢病毒具有高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广、感染效率高、与细胞染色体整合不需要基因重排等优点，是制备稳定细胞系的理想载体 。
稳定细胞株的一般服务流程
1.载体构建病毒包
一般来说，将人源化抗体基因转移到慢病毒载体上，然后检测质粒的表达，包装得到过量表达目的基因的慢病毒质粒 。将慢病毒载体系统的包装组分与用于包装的载体组分一起转染到293细胞中 。24至48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩并测试滴度 。
图1病毒包装细胞感染
2.细胞转染
真核表达载体常用的抗性标记有嘌呤霉素、潮霉素和新霉素 。首先确定嘌呤霉素/G418的筛选浓度和病毒转染浓度，然后将病毒悬液转染细胞24小时，用嘌呤霉素/G418筛选稳定的转化子，用ELISA和WB鉴定 。
3.单克隆
利用Molecular ClonePix2系统，高通量自动筛选100-200个高水平分泌克隆，选出10个最佳高产克隆用于下一步稳定性试验 。
4.细胞系的稳定筛选
几代细胞系后，可能会出现遗传不稳定 。我们选择了最佳的10个克隆，经过10次传代后，用qPCR和WB方法检测细胞系的稳定性 。最后，我们提供了序列和载体的报告，三种最佳表达的细胞系，表达分析，稳定性测试报告和详细的稳定细胞系构建报告 。
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